安捷伦1260液相系统的自动化柱前衍生功能实现伏马毒素的高通量检测

简介
        伏马毒素 (FUM) 是一种强毒性真菌毒素，普遍存在于玉米、小 麦、大米等粮食作物中，对动物和人的健康有很大的潜在危害[1]。 1993 年，伏马毒素被世界卫生组织的癌症研究机构划定为 2B 类 致癌物（即人类可能致癌物）[2]。 目前发现的伏马毒素有 FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、 FC2、FC3、FC4 和 FP1 等 11 种，其中主要组分为 FB1，已成 为继黄曲霉毒素之后的又一研究热点。目前，我国对伏马毒素尚 无明确的*规定，但许多组织、已对伏马毒素制订了限 量标准。欧盟对伏马毒素（FB1 和 FB2）的总量规定玉米中* 为 4 mg/kg[3]；瑞士规定人类食物中伏马毒素*为 1 mg/kg[4]； 美国 FDA 规定以玉米为原料的食品中 FB 的大*为 2–4 mg/kg， 动物食品为 5–100 mg/kg[5]。 我国颁布的食品安全标准中，伏马毒素的液相色谱检测方法 包括柱后衍生和柱前衍生两种[3]。柱后衍生方法分析时间较长， 且仪器配置除了一台液相色谱外，还需要一套柱后衍生系统。而 柱前衍生方法步骤又非常繁琐，需要先用移液器分别移取 100 µL 样品和衍生试剂，再加入样品瓶涡旋约 30 秒，并在 2 分钟内进 样分析，整个衍生时间需要人为控制。而且，为了保证衍生反应 时间一致，必须完成一针进样后才能做下一个样品前处理，整个 过程需要操作人员全程值守。 本方法在《GB5009.240-2016 食品安全标准 食品中伏马毒 素的测定》[6] 中规定的柱前衍生方案的基础上，运用 Agilent 1260 Infinity II 液相色谱系统的程序进样功能，开发出一种自动化柱前 衍生的高通量快速分析方法。该方法无需额外配置设备，无需人 员值守，具有良好的重现性，而且定量限和检测限指标* 各项主要法规的要求。

实验部分
仪器和设备 
Agilent 1260 Infinity II 液相色谱系统，配备如下安捷伦组件： 
– Agilent 1260 Infinity II 四元泵（部件号 G7111B）
– Agilent 1260 Infinity 标准自动进样器（部件号 G7129B） 
– Agilent 1260 Infinity 柱温箱（部件号 G7116A） 
– Agilent 1260 Infinity 荧光检测器（部件号 G7121B），配备标准检 测池 (8 µL) 

标样配制
        将伏马毒素 FB1 和 FB2 标准混合储备液用乙腈/水 (50%/50%) 逐级 稀释为 2500、500、250、125、75、25 和 10 ng/mL，分别对应 于浓度级别 7、6、5、4、3、2、1。
 

表 1. 标样配制 

自动衍生步骤 
        硼砂溶液和衍生试剂参照《食品安全标准 食品中伏马毒素的 测定》中第三法的规定进行配制。 硼砂溶液 (0.1 mol/L)：称取硼砂 3.8 g，用水溶解并稀释至 100 mL，混合均匀。取该溶液 1 mL 置于 2 mL 样品瓶中，放在 自动进样器的 P1-A1 位置。 
        衍生试剂：准确称取 40 mg 邻苯二甲醛，溶于 1 mL 甲醇中，用 5 mL 硼砂溶液进行稀释，并加入 50 μL 2-巯基乙醇，混合均匀。 取该溶液 100 μL 置于 250 μL 内插管中，然后将内插管放入 2 mL 棕色样品瓶中，放在自动进样器的 P1-A2 位置。剩余衍生试剂放 入 –20 °C 冰箱中冷藏，1 周内使用未发现异常。
 

表 2. 自动衍生方法设置

色谱条件 

结果与讨论
        使用上述方法对伏马毒素 FB1 和 FB2 标准样品进行分析，第 5 级 浓度的标准样品分析结果如图 1 所示。结果表明，采用 Plus C18 超短色谱柱对衍生产物进行分离，能够在 9 min 内获得良好 的分离效果，分离时间较标准方法所需的 16 min 缩短了近 一半。
 

图 1. 250 ng/mL 伏马毒素标准样品中 FB1 和 FB2 的分离结果

峰面积和保留时间重现性考察 
        对第 3 级浓度 (75 ng/mL) 的伏马毒素标样进行 5 次重复分析，以 考察峰面积和保留时间的重现性。结果显示 FB1 和 FB2 的保留时 间 RSD% 均小于 0.2%，且峰面积 RSD% 均小于 1.1%，满足 标准中两次独立测定结果的差值不超过算数平均值 20% 的要求， 具体结果见表 3。之所以能够获得良好的峰面积重现性，主要是 由于自动化柱前衍生过程中涉及的样品和溶剂的量取均采用高精 度计量泵来实施。而且，整个衍生反应流程一致，时间恒定，从 而使得衍生效果稳定，定量结果可靠。

表 3. FB1 和 FB2 的保留时间和峰面积重现性 (n = 5)

线性范围考察 
        依次将不同浓度的标准样品按浓度从低到高进样，每个浓度点进 样三次，以浓度为横坐标、每个浓度下 FB1 和 FB2 峰面积的平均 值为纵坐标绘制标准曲线，结果如图 2 所示。无论是在低浓度范 围 (10–500 ng/mL) 还是在高浓度范围 (10–2500 ng/mL)，FB1 和 FB2 均获得了良好的线性相关性，相关系数均大于 0.9999。
 

图 2. FB1 和 FB2 的低浓度范围（10–500 ng/mL，A 和 C）和高浓度范围（10–2500 ng/mL，B 和 D）标准曲线

灵敏度考察 
        对第 1 级浓度 (10 ng/mL) 的标样进样分析以考察方法的灵敏度。结果如图 3 所示。在该浓度下，FB1 的信噪比为 94，FB2 的信 噪比为 143。由此推断，FB1 和 FB2 的检测限可达 300 pg/mL 左右，定量限可达 1 ng/mL 左右；而标准中指出，当称样量为 5 g 时，FB1、FB2 的检测限分别为 17 μg/kg、8 μg/kg，定量限分别为 50 μg/kg、25 μg/kg。因此，本方法*标准方法 要求。
 

图 3. 10 ng/mL 伏马毒素标样中 FB1 和 FB2 的分离结果

结论
        本研究使用 Agilent 1260 Infinity II 液相色谱系统的程序进样功 能，对伏马毒素 FB1 和 FB2 进行自动衍生，可有效防止 FB1 和 FB2 衍生产物的降解。与标准方法相比，该方法可大幅提高 检测效率，降低实验室人工成本。并且该方法具有非常良好的灵 敏度、线性和重现性，检测结果可靠，是一种非常适合于大批量 样品高通量分析的方法。 


参考文献
1. W.J. Kong, et al. Analysis of fumonisins B1 and B2 in spices and aromatic and medicinal herbs by HPLC-FLD with on-line post-column derivatization and positive confirmation by LCMS/MS. Analyst, 2012, 137: 3166-3174
2. K. C.Piancentini, et al. Mycotoxin analysis of industrial beers from Brazil: The influence of fumonisin B1 and deoxynivalenol in beer quality. Food Chem. 2017, 218: 64-69
3. SENYUVA Hamide, et al. Determination of Fumonisins B1 and B2 in Corn by LC/MS with Immunoaffinity Column Cleanup: Interlaboratory Study. JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL 2010, 93, 611-621 
4. Ildiko′Barna-Vetro′, et al. Development of a sensitive ELISA for the de termination of fumonisin B1 in cereals. J Agric Food Chem. 2000, 48, 2821- 2825 
5. USFDA. Draft guidance for industry: fumonisin levels in human foods and animal feeds. 2006 6. GB5009. 240-2016 食品安全标准 食品中伏马毒素的测定
 

来源：安捷伦科技有限公司