液相色谱的定性定量分析

一、定性分析

在高效液相色谱中，常用的定性分析有下列五种方法。

1、利用已知标准样定性

由于每一种化合物在特定的色谱条件下有其特定的保留值，如果在相同的色谱条件下，被测物与标样的保留值相同，则可初步认为被测物与标样相同。

2、利用紫外和荧光光谱定性

由于不同的化合物有其不同的紫外吸收或荧光光谱，对检测池中的待检样品进行全波长（180～800nm）扫描，得到紫外可见光或荧光光谱图；再用相应标准品，按同样方法处理，也得到一个光谱图，比较这两张图谱，即可鉴别该样品是否与标准品相同。对于某些有特征光谱图的化合物，也可以与所发的标准图谱来比较以进行定性。

3、收集柱后流出组分，再用其他化学或物理方法定性

液相色谱常用化学检测器，被测物经过检测器后不受破坏，所以可以收集各组分，然后再用红外光谱、质谱、核磁共振等方法进行鉴定。

4、HPLC 指纹图谱分析法

HPLC 指纹图谱分析法是指纹图谱与 HPLC 相结合的一种分析方法，目前已成为中药质量控制的方法，适用于中药复杂成分的分离、分析和指纹图谱的建立。在食品上主要用于天然成分的分析。被分离、分析物质预处理后用HPLC 测定出色谱峰，经过计算机库存信号的检索及对质谱图的解析，对所含成分做出定性鉴定。

5、建立液相色谱定性方法

可根据以下几点，建立合理的液相色谱分析方法：选择合适的分析样品的液相色谱方法；选择合适的柱子；选择合适的k（峰容量因子）的条件；确定良好的峰位（α）；选择良好的柱条件（最佳 N 值）。

根据样品的情况，如分子量是大于2000还是小于2000，样品是溶于水还是不溶于水，确定选择何种液相方法。

选择溶剂强度配成适宜的流动相，以得到理想的k，使k尽量在1～10的范围内（特殊情况也允许0.5<k<20）。溶剂的黏度也很重要，一般黏度要小于2×10-3Pa·s。

二、定量分析

在高效液相色谱分析中常用的定量分析方法有外标法和内标法。

1、外标法

外标法是以被测化合物的纯品或已知其含量的标样作为标准品，配成一定浓度的标准系列溶液，注入色谱仪，得到的响应值（峰高或峰面积）与进样量在一定范围内成正比。用标样浓度对响应值绘制标准曲线或计算回归方程，然后用被测物的响应值求出被测物的量。

2、内标法

内标法是在样品中加入一定量的某一物质作为内标进行的色谱分析，被测物的响应值与内标物的响应值之比是恒定的，此比值不随进样体积或操作期间所配制的溶液浓度的变化而变化，因此可得到较准确的分析结果。

具体操作步骤如下。

（1）先准确称取被测组分 a 的标样 Wa内标物，加入一定量溶剂混合，即得混合标样。取任意体积（μL）注入色谱仪，得色谱峰面积Aa（被测组分a标样峰面积）及峰面积As（内标物峰面积），用下式计算相对响应因子Sa。

（2）称取被测物W，然后加入准确称重的内标物W's，加入一定体积的溶剂混合。取任意体积（μL）注入色谱仪，测得被测组分a的峰面积A'a，内标物峰面积为A's。按下式计算被测物中 a 组分的质量W'a。

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