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技术文章
近年来，大家对基因治疗药物的关注激增。为了保证治疗有效，必须将转基因（基因载荷）正确地运送到目标细胞内。其中腺相关病毒（AAV）作为载体具有众多优点，因此被广泛用作基因运送工具。
随着AAV在临床上的应用越来越广泛，了解它的质量属性对产品疗效和安全性的影响变得很有必要。目前用于表征AAV的分析技术也有很多，其中包含离子交换色谱（IEX）、体积排阻色谱（SEC）、反相液相色谱（RPLC）和亲水作用色谱（HILIC）等的色谱方法被越来越多地应用起来。以下是四种表征AAV的色谱分析策略分享。
阴离子交换色谱法（AEX）
测定AAV中空衣壳和完整衣壳含量
Protein-Pak Hi Res Q, 5 μm, 4.6×100 mm（部件号：186004931）
图1. 在Protein-Pak Hi Res Q⾊谱柱上分离AAV8空⾐壳和完整⾐壳混合物。20 mM Tris pH 9，NaCl在20 min内从 0增加⾄300 mM，流速0.4 mL/min。a‒c)进样6 μL。a) 260 nm处的TUV。b) 280 nm处的TUV。c)荧光检测：激 发波⻓280 nm，发射波⻓350 nm。d)进样0.5 μL的荧光检测结果。20 mM Tris pH 9，NaCl在20 min内从50增加 ⾄250 mM，流速0.4 mL/min。
图2. 使⽤优化的AEX⽅法定量各种AAV8空⾐壳和完整⾐壳混合物中的空⾐壳百分⽐。
A.
UV检测结果：由于260 nm处病毒DNA的吸光度高于衣壳蛋白，280 nm处衣壳蛋白吸光度高于DNA，所以完整衣壳在260 nm处的峰面积大于280 nm处，而空衣壳在260 nm处的峰面积小于260 nm处；
B.
同样的分离方法下，荧光信号远高于UV检测信号；
C.
使用从缓冲液pH值、盐类型、缓冲液类型和镁离子浓度等方面优化的AEX分离方法后监测AAV8样品中的空衣壳/完整衣壳，得到较好的线性结果。
XBridge Premier GTx BEH SEC色谱柱，450Å，2.5 µm，4.6 x 150 mm（
部件号：186010584）
图3. 分别使用流速0.6 mL/min（2.5 μm颗粒，5分钟分析时间，黑色曲线）的XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 µm柱；和流速0.05 mL/min（5 μm颗粒，50分钟分析时间，红色曲线）的参考500 Å柱所获得的AAV2（A）、AAV9（B）、AAV5-空（C）和AAV5-满（D）SEC色谱图的放大视图。
A.
相比5 μm的色谱柱，XBridge Premier GTx BEH 450 Å 2.5 μm具有更高的柱效，使得AAV的分离进一步提升；
B.
拥有MaxPeak HPS技术的XBridge Premier GTx BEH 450 Å色谱柱由于避免了次级作用力，分离结果重现性更高。
反相液相色谱法
分离AAV载体中的衣壳蛋白（VP）
ACQUITY UPLC BEH C4, 1.7 μm, 300 Å, 2.1 ×100 mm蛋⽩分析专⽤柱（部件号：186004496）
图4. AAV8⾐壳蛋⽩分析⽅法开发。(A) 使⽤ACQUITY UPLC BEH C8⾊谱柱并以甲酸作为流动相改性剂得到的分离结果；(B) 使⽤相同的ACQUITY UPLC BEH C8⾊谱柱，以DFA作为流动相改性剂得到的分离结果；(C) 使⽤ACQUITY UPLC BEH C4⾊谱柱并以DFA作为流动相改性剂，分离度有所提升。梯度：(A) 流动相A在32 min内从70%降⾄ 62%；(B) 流动相A在16 min内从67%降⾄63%；(C) 流动相A在16 min内从68%降⾄64%。流速：0.2 mL/min。
A.
相较于甲酸等传统的流动相添加剂，二fu乙酸更有利于各衣壳蛋白的色谱分离，同时保持出色的MS灵敏度；
B.
对比130 Å的C18，孔径为300 Å的C4使得VP1、VP2得到进一步分离，峰宽更窄，MS响应进一步提高。
亲水作用色谱
分离AAV载体中的衣壳蛋白（VP）
ACQUITY UPLC Amide糖蛋白分析专用柱， 300 Å, 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm（部件号：186007963)
图5. 使用以下两款 LC 色谱柱分离AAV6、AAV7和AAV8 衣壳病毒蛋白(VP)所得的谱图对比：(a) Waters ACQUITY UPLC Amide糖蛋白分析专用柱(300 Å, 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm)和(b)Waters ACQUITY BEH C4色谱柱(300 Å, 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm)。在λem = 280 nm 和λex = 348 nm 波长下监测荧光强度(EU)，且所有样品的荧光强度都经过归一化处理。FD的谱峰归属根据准确质量数测定结果做了确认，标示如下：Ox：氧化；P：磷酸化。
ACQUITY BEH Amide色谱柱、ACQUITY BEH C4色谱柱在相同的离子对试剂（0.1%TFA v/v），且单位时间流动相B的变化也相同（%B/min）条件下分离三种不同AAV血清型的衣壳蛋白。结果表明ACQUITY BEH Amide色谱柱可以更好地分离VP变体。
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